Principy syntézy nukleových kyselin

Syntéza nukleových kyselin se provádí metodou sialového amidu triglyceridu na pevné fázi, kdy je 3' konec DNA imobilizován na substrátu pevné fáze a nukleotidy jsou přidávány ve směru 3' až 5', dokud není syntetizován požadovaný fragment DNA. .To se liší od syntézy DNA aplikací DNA polymerázy.

3′ konec první báze je během syntézy imobilizován na CPG, 5′-OH další báze je chráněna di-p-tolyltrityl DMT, aminoskupina na bázi je chráněna kyselinou benzoovou a 3′ -OH se poté aktivuje aminofosfátovou sloučeninou.1 báze z 5 5′-OH z 1 báze a 3′-OH z další báze tvoří fosfittriglycerid, který se následně oxiduje jodem na fosforečnan triglycerid, ochranný prostředek na druhé bázi 5′-OH se odstraní tzv. přidání kyseliny dichloroctové DM cykluje přidáním další báze a po syntéze se ochranný prostředek na 5'-OH odstraní slabou kyselinou Fragment se odpojí od pevné pryskyřice koncentrovaným hydroxidem amonným, ochranný prostředek se odstraní z báze s koncentrovaným hydroxidem amonným za zahřívání se hydroxid amonný odstraní, fragment se suší ve vakuu a nukleová kyselina se čistí kapalinovou chromatografií nebo PAGE.

Kroky syntézy oligo

Deblokování

The5 koncová DMT chránící skupina se odstraní přidáním roztoku TCA.

Aktivace

Smíchání aktivátoru s oligonukleotidovým monomerem za vzniku aktivního oligonukleotidového monomerního meziproduktu.

Spojka

5-koncová hydroxylová skupina reaguje s aktivním oligonukleotidovým meziproduktem v antigenerativní kondenzační reakci za vzniku nestabilní fosfittriglyceridové vazby.

Uzavření 

Přidání uzavíracího činidla provede acetylační uzavírací reakci s přebytkem hydroxylových skupin, které se neúčastní kondenzační reakce.

Oxidace 

Přidání roztoku jódu obsahujícího vodu reaguje s nestabilními fosfitovými vazbami oxidací za vzniku stabilních triglyceridových vazeb kyseliny fosforečné.

Kyanoethylové štěpení

Produkt nukleové kyseliny po syntéze s přidáním roztoku DEA k odstranění kyanoethylové skupiny z fosfátové triglyceridové vazby.

Cleaved&Deprotection

Fragmenty nukleové kyseliny se odštěpí od nosiče v pevné fázi přidáním koncentrovaného roztoku hydroxidu amonného a poté se zahřejí, aby se odstranily chránící skupiny z vodíkových vazeb bází.